Einleitung

Für eine leitliniengerechte Therapie des Mammakarzinoms werden als Grundlage für die informierte Behandlungsplanung zunehmend molekularpathologische Analysen benötigt. Die klassische Pathologie bildet weiterhin die Grundlage der Diagnostik, sichert die Diagnose und liefert ein deskriptives Bild des Krebsgeschehens. So erfolgt die Primärdiagnostik und die Einteilung in molekulare Subtypen des Mammakarzinoms mithilfe immunhistochemischer Methoden. Zielstrukturen für endokrine und etablierte gegen Human Epidermal Growth Factor Receptor (HER2) -gerichtete monoklonale Antikörper sind ebenfalls mittels konventioneller Methoden nachweisbar. Die molekulare Diagnostik ergänzt zunehmend die klassische Pathologie und gibt einen funktionellen Einblick in die Tumorbiologie. So können tumortreibende Mechanismen gezielt identifiziert und ggf. mithilfe zielgerichteter Therapien adressiert werden. Diese Fortbildung gibt einen Überblick über die heute für die Therapieplanung erforderlichen molekularpathologischen Analysen sowie deren Durchführung und informiert über die infrastrukturellen Anforderungen an die interdisziplinäre Zusammenarbeit, damit die komplexen Analyseergebnisse für die Patientenversorgung genutzt werden können.

Molekulare Diagnostik beim frühen Mammakarzinom

Multigentests werden bisher beim frühen Mammakarzinom hauptsächlich dann herangezogen, wenn beim hormonrezeptorpositiven HER2-negativen Mammakarzinom, und hier besonders beim Luminal-B-Typ, der Nutzen einer adjuvanten Chemotherapie anhand klinischer Parameter nicht ausreichend abgeschätzt werden kann). Für die bessere Beurteilung des Rückfallrisikos stehen dazu seit einigen Jahren Multigentests zur Verfügung. Diese erfassen die Expression von krebsrelevanten Genen und ermöglichen die quantitative Abschätzung des Rückfallrisikos bzw. den wahrscheinlichen Nutzen einer adjuvanten chemoendokrinen Therapie gegenüber einer alleinigen endokrinen Therapie. Ob der Einsatz eines Multigentests für eine Patientin sinnvoll ist, sollte im individuellen Einzelfall nach Abklärung der klinisch-pathologisch relevanten Parameter, die Aufschluss über die Prognose und das individuelle Rezidivrisiko geben können, empfohlen werden. Bisher war beim frühen Mammakarzinom die Bestimmung weiterer molekularer Biomarker für die Therapieplanung nicht gefordert, weil zielgerichtete Therapieoptionen, die die Bestimmung molekularer Marker erfordern würden, für dieses Erkrankungsstadium noch nicht zur Verfügung standen. Eine Ausnahme stellt die Keimbahnanalyse des BRCA1/2-Gens (gBRCA1/2) beim triple-negativen Mammakarzinom dar. Die Testung diente zur Abklärung eines möglichen familiären Risikos, war bisher jedoch nicht relevant für die Abschätzung der Wirksamkeit zielgerichteter Therapien. Zukünftig wird der Nachweis einer BRCA1/2-Mutation für die Therapie des HER2-negativen Mammakarzinoms (HR+, HER2-negativ und triple-negativ) therapierelevant werden. Die Ergebnisse der OlympiA-Studie haben belegt, dass Patientinnen mit frühem HER2-negativen Mammakarzinom und mit gBRCA-Mutation von der adjuvanten Therapie mit dem Poly-(ADP-ribose-)Polymerase-(PARP-)Inhibitor Olaparib, der bereits in der metastasierten Situation zugelassen ist, mit einem verbesserten invasiven krankheits- und fernmetastasenfreien Überleben profitieren.

Obligatorische molekulare Diagnostik des metastasierten Mammakarzinoms

Anders als beim frühen Mammakarzinom, bei dem die prädiktive molekulare Diagnostik noch am Anfang steht, zeichnet sich beim metastasierten Mammakarzinom ein Paradigmenwechsel ab. Alterationen in den Genen BRCA1 und BRCA2, PIK3CA und optional NTRK haben bereits therapeutische Implikationen.

BRCA-Diagnostik

Patientinnen mit HER2-negativem, lokal fortgeschrittenen oder metastasiertem Brustkrebs können mit PARP-Inhibitoren behandelt werden, wenn Keimbahnmutationen in den Tumorsuppressorgenen BRCA1 bzw. BRCA2 nachweisbar sind. Bei der Analyse auf Keimbahn-BRCA-Mutationen mit der Zielsetzung einer geplanten PARP-Inhibitortherapie handelt es sich um eine sogenannte diagnostische genetische Untersuchung nach dem Gendiagnostikgesetz (GenDG). Diese erfolgt an einer Blutprobe und kann von jedem approbierten Arzt veranlasst werden. Vor der Testung ist keine humangenetische Beratung erforderlich, aber die Patientin muss vom veranlassenden Arzt über diese Untersuchung aufgeklärt werden und muss ihr Einverständnis schriftlich erklärt haben. Im Falle einer Keimbahnmutation sollte eine Beratung der Familienangehörigen bevorzugt in einem Konsortialzentrum für das familiäre Mamma- und Ovarialkarzinom angeboten werden.

Nachweis einer PIK3CA-Mutation

Beim Mammakarzinom sind Veränderungen im PIK3CA-Gen mit etwa 40 % die häufigsten Mutationen. Therapierelevant ist der Nachweis einer PIK3CA-Mutation seit Zulassung des PIK3CA-Inhibitors Alpelisib in Kombination mit dem Östrogenrezeptor-Antagonisten Fulvestrant beim Hormonrezeptorpositiven endokrin vortherapierten metastasierten Mammakarzinom. Die Testung wird von der Pathologie durchgeführt und erfolgt an Tumorgewebe oder an freier Tumor-DNA aus einer Plasmaprobe (Liquid Biopsy). Für die Testung an Gewebe sollte möglichst aktuelles Tumorgewebe verwendet werden; falls möglich, ist eine Testung an Metastasengewebe einer Testung an Primärtumorgewebe vorzuziehen. Bei Nachweis einer PIK3CA-Mutation muss derzeit die Kostenübernahme für Alpelisib beantragt und der Wirkstoff über die internationale Apotheke angefordert werden.

NTRK-Fusion

Die NTRK-Inhibitoren Larotrectinib und Entrectinib sind indikationsübergreifend bei soliden Tumoren mit NTRK-Fusionen und lokal fortgeschrittener oder metastasierter Erkrankung zugelassen. Die Genveränderungen sind selten, und die Analytik ist aufwendig. Wird aber eine entsprechende Genveränderung nachgewiesen, können die Patientinnen langanhaltend von der Therapie mit NTRK-Inhibitoren profitieren. Die Deutsche Gesellschaft für Hämatologie und Medizinische Onkologie (DGHO) empfiehlt daher in einem Positionspapier die Testung, wenn der Einsatz eines NTRK-Inhibitors bei dem jeweiligen Krankheitsbild die beste verfügbare Therapieoption darstellt. Beim Mammakarzinom sind NTRK-Fusionen extrem selten und wurden bisher nur beim sekretorischen Mammakarzinom nachgewiesen. In diesem Fall ist daher eine entsprechende Analytik sinnvoll.

Erweiterte molekulare Diagnostik des metastasierten Mammakarzinoms

Mithilfe moderner Sequenzierverfahren können DNA-Proben auf zahlreiche Genveränderungen hin untersucht werden, bis hin zur Sequenzierung des Gesamtexoms oder Gesamtgenoms. Eine Analyse ist jedoch nur dann sinnvoll und kosteneffizient, wenn das Ergebnis das klinische Vorgehen beeinflussen kann. Beim Mammakarzinom können über die Bestimmung des Status prädiktiver obligatorischer Biomarker hinaus Informationen über mögliche Resistenzmechanismen sowie über die potenzielle Wirksamkeit von derzeit in klinischen Studien untersuchten Therapieoptionen gewonnen werden. Die Indikation für eine erweiterte Diagnostik sollte von der Tumorkonferenz gestellt werden, wenn die Therapieplanung umfassende Informationen zur Tumorbiologie erfordert. Die Organkommission Mamma der Arbeitsgemeinschaft für Gynäkologie e. V. empfiehlt in ihrer aktuellen Leitlinie neben der Testung auf BRCA1/2, PIK3CA und optional NTRK-Aberrationen die Testung auf ESR1-Mutationen, die auf Resistenzen gegen endokrine Therapien hinweisen. Außerdem sollten ERBB2-Mutationen analysiert werden, um eine Therapiemöglichkeit mit Neratinib bzw. Lapatinib zu prüfen. Zudem kann der Nachweis einer Mikrosatelliteninstabilität (MSI) auf die potenzielle Wirksamkeit von Immuncheckpoint-Inhibitoren hinweisen. Auch Resistenzmutationen gegen CDK4/6-Inhbitoren wie z. B. der Verlust des RB1-Gens können auftreten. Außerdem gibt es Studien zu Medikamenten, die beim Vorliegen von AKT- bzw. PTEN-Mutationen downstream im PIK3CA-Signalweg wirken können. Idealerweise sollen Genpanel verwendet werden, die die Analyse der genannten Genveränderungen parallel erlauben. Bei Durchführung von solchen umfassenden Analysen wird eine Teilnahme an klinischen Studien oder strukturierten Programmen empfohlen.

Ablauf der molekularen Analytik

Damit die molekulare Diagnostik flächendeckend im klinischen Alltag genutzt werden kann, müssen die entsprechenden Rahmenbedingungen für die interdisziplinäre Zusammenarbeit geschaffen werden. Zudem sind Investitionen in leistungsfähige Technologien zur Datenanalyse und Interpretation erforderlich. Die Beauftragung von molekularen Analysen sollte schnell und – wo immer möglich – nach definierten, in der Tumorkonferenz festgelegten Algorithmen erfolgen. Reflextestungen, das heißt, die automatische Durchführung bestimmter Analysen bei vordefinierten Diagnosen, können die Gewinnung von therapierelevanten Informationen beschleunigen. Ob für die Therapieplanung somatische Mutationen an Tumorgewebe oder an einer Liquid Biopsy bestimmt werden müssen oder ob der Nachweis von Keimbahnmutationen an einer Blutprobe erforderlich ist, hängt von der jeweiligen Zulassung der geplanten zielgerichteten Therapien ab. So ist für die Anwendung von PARP-Inhibitoren beim HER2-negativen (HR+, triple negativ) Mammakarzinom der Nachweis von BRCA-Keimbahnmutationen gefordert. Dagegen kann für die Testung auf PIK3CA-Mutationen sowohl Plasma als auch eine Tumorgewebeprobe verwendet werden. NTRK-Alterationen werden ebenfalls anhand von Tumormaterial nachgewiesen. Da hier komplexe Genfusionen detektiert werden müssen, wird die Analyse auf Transkriptebene anhand von mRNA durchgeführt. Zum Nachweis somatischer Mutationen arbeitet die lokale Pathologie Tumorproben in qualitätsgesicherten Prozessen auf und übergibt Probenmaterial an die Molekularpathologie zur DNA-Extraktion und Sequenzierung. Für die erfolgreiche Durchführung der molekularen Analysen ist eine hohe Probenqualität notwendig. Gewebeproben müssen daher unbedingt ausreichend Tumorzellen bzw. eine Liquid Biopsy ausreichend Tumor-DNA enthalten. Ist der Nachweis einer Keimbahnmutation gefordert, wird Blut an die lokalen Kooperationspartner der Humangenetik oder des Deutschen Konsortiums für Familiären Brust- und Eierstockkrebs versendet. Welche Methoden die Molekularpathologie für die beauftragten Analysen verwendet, richtet sich nach der jeweiligen Fragestellung unter Berücksichtigung der Kosteneffizienz. Zunehmend werden Next-Generation-Sequencing (NGS)-Technologien genutzt, die in einem Schritt die Analyse von vielen bekannten therapierelevanten Genveränderungen ermöglichen und einen umfassenden Überblick über die Tumorbiologie geben können. An vielen universitären Tumorzentren und gut ausgestatteten molekularpathologischen Laboren sind diese Methoden bereits verfügbar. Auch bei der BRCA-Diagnostik durch die Humangenetik und das Deutsche Konsortium Familiärer Brust- und Eierstockkrebs ist die NGS-Technologie unverzichtbar. Die European Society for Medical Oncology (ESMO)-Organisation empfiehlt die Nutzung NGS-basierter Multigenanalysen durch Zentren, die Zugang zu klinischen Studien haben, um den Zugang zu innovativen Therapien zu verbessern und die klinische Forschung zu beschleunigen. Durch die gleichzeitige Sequenzierung von Millionen kurzer DNA-Fragmente generiert NGS eine enorme Menge an Rohdaten, die analysiert werden müssen, um das Vorliegen einer Mutation zu bestätigen oder auszuschließen. Die Interpretation von NGS-Daten ist hoch komplex und erfordert die Expertise entsprechend ausgebildeter Fachkräfte. Die gewonnenen Sequenzdaten werden bioinformatisch mit dem humanen Referenzgenom abgeglichen, um abweichende Veränderungen zu erfassen. Die Verlässlichkeit der Informationen wird von der Molekularpathologie bewertet. Anschließend wird die therapeutische Bedeutung der detektierten Genveränderungen in der Regel anhand von öffentlich zugänglichen Datenbanken recherchiert und die Varianten nach ihrer Bedeutung in fünf Stufen klassifiziert. Für die Therapie beispielweise mit PARP-Inhibitoren müssen BRCA-Varianten der Klasse 4 (wahrscheinlich pathogen) oder 5 (sicher pathogen) nachgewiesen werden. Sind die gefundenen Varianten klassifiziert, muss eine Interpretation der klinischen Bedeutung der Varianten erfolgen. Mit wachsender Komplexität der Analysen werden hier zunehmend intelligente Softwarelösungen wie z. B. MH Guide, Pierian DX, Ion Reporter oder QCI Interpret verwendet, die die zeitraubenden Recherchen in Datenbanken für die Variantenklassifikation (sog. Annotation) automatisiert durchführen und außerdem die klinische Interpretation unterstützen und standardisieren. Für die Anwender in der Molekularpathologie ist hierbei die Integrierbarkeit in lokale Laborprozesse und eine regelmäßige und verlässliche qualitätsgesicherte Aktualisierung der verwendeten Datenbanken von höchster Relevanz. Damit die Ergebnisse der molekularen Analytik in den Pathologiebefund einfließen können und für die Falldiskussion und Therapieplanung nutzbar sind, ist darüber hinaus die transparente und nachvollziehbare Auswertung zur klinischen Bedeutung der detektierten Genveränderungen essenziell. Softwarelösungen, die diese Voraussetzungen erfüllen und einen Überblick über potenziell wirksame Therapieoptionen, Hinweise auf Resistenzen oder Sicherheitsrisiken und insbesondere auch geeignete klinische Studien geben, werden in Zukunft immer mehr an Bedeutung gewinnen. Zur Auswertung der molekularen Diagnostik wird vom Molekularpathologen ein Bericht erstellt, der in den Pathologiebefund einfließt. Dieser fasst die Ergebnisse der NGS-Analyse zusammen und informiert umfassend über die verwendete Methodik, die detektierten Genvarianten, deren klinische Relevanz mit funktionellen Konsequenzen und Hinweisen auf potenziell wirksame Substanzklassen mit zugelassenen zielgerichteten Therapien sowie über eine mögliche Evidenz für Off- Label-Therapien und geeignete klinische Studien. Dieser Befund wird dem Auftraggeber der molekularen Analytik zur Verfügung gestellt und üblicherweise zur Therapieplanung in der Tumorkonferenz diskutiert. Der molekularpathologische Befund informiert über

• Probenmaterial,
• verwendete Methodik,
• detektierte Genvarianten,
• potenziell wirksame zielgerichtete Therapien, Evidenz für Off-Label-Therapien,
• geeignete klinische Studien.

Falldiskussion im molekularen Tumorboard

Liegt der molekularpathologische Befund vor, ist besonders bei umfassenden Multigentests die Frage nach der klinischen Bedeutung der Ergebnisse und der weiteren Vorgehensweise nicht immer eindeutig zu beantworten. Um eine Struktur für die Diskussion von komplexen Ergebnissen molekularer Analysen zu schaffen, wurden von vielen Zentren spezielle molekulare Tumorboards etabliert. Hier können von lokalen Einsendern der jeweiligen veranstaltenden Molekularpathologien beispielweise Fälle mit fraglicher klinischer Konsequenz der Analyseergebnisse eingebracht werden. Auch in Fällen, in denen die Standardtherapien bereits ausgeschöpft oder Resistenzen aufgetreten sind, können die Fallbesprechungen im molekularen Tumorboard Möglichkeiten für weiterführende molekulare Analysen aufzeigen. Mit zunehmendem Bedarf an umfassenderen molekularen Analysen wird die Bedeutung der molekularen Tumorboards für das Mammakarzinom zunehmen. Dies stellt Anforderungen an die rechtzeitige Schaffung der entsprechenden Infrastruktur.

Fazit

• Für eine leitliniengerechte Therapie des Mammakarzinoms werden zunehmend molekularpathologische Analysen benötigt.
• Für Alterationen in den Genen BRCA1 und BRCA2, PIK3CA und NTRK sind zielgerichtete Therapieoptionen für das metastasierte Stadium verfügbar.
• Durch eine erweiterte molekulare Diagnostik können darüber hinaus mögliche Resistenzmechanismen sowie potenziell geeignete klinische Studien identifiziert werden.
• Intelligente Softwarelösungen können die Interpretation molekularpathologischer Analysen unterstützen und die interdisziplinäre Zusammenarbeit erleichtern.
• Molekulare Tumorboards ermöglichen die interdisziplinäre Diskussion von Fällen mit fraglicher klinischer Konsequenz der Analyseergebnisse.

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